انواع محیط کشت میکروبی و اصول تهیه آنها

میکروارگانیسم ها همانند سایر موجودات زنده برای ادامه زندگی به محیط زیست نیاز دارند که مواد لازم جهت متابولیسم و تکثیر آنها را دارا باشد.ضمنا این محیط باید دارای دما,فشار اسمزی و PH  مناسب نیز در حدود ۲/۷ باشد.میکروارگانیسم ها علاوه بر محیط های زیست طبیعی خود توانایی زندگی در محیط های ساخته شده را نیز دارند که آنها را محیط کشت مصنوعی می نامند.

انواع محیط کشت

محیط های کشتی که در میکروب شناسی به کار برده می شوند انواع مختلف دارند و آنها را می توان از جنبه های گوناگون از جمله حالت و از نظر متمایز سازی تقسیم بندی کرد.

انواع محیط کشت از نظر حالت

۱-محیط کشت جامد (Solid ):

این محیط کشت دارای پسوند آگار می باشد چرا که به نسبت ۲ تا ۳ درصد حاوی آگار بوده و همین میزان آگار می تواند باعث جامد شدن یک محیط کشت جامد گردد.آگار تجارتی ماده خشک است شبیه سلولز که اگر در آب سرد ریخته شود باد می کند و اگر بجوشد کاملا حل می شود در عین حال در کمتر از ۴۵ ذرجه سانتی گراد به حالت جامد درمی آید.آگار به حد کافی مواد غذایی ندارد و باید آن را با مواد غذایی دیگر مخلوط کرده و مورد استفاده قرار داد نوترین آگار مثالی از یک محیط کشت جامد است.

محیط کشت نیمه جامد (semisolid):

این نوع محیط کشت به وسیله اضافه کردن ۱ تا ۵/۱ درصد آگار به محیط کشت مایع کشت دارای پسوند مدیوم (medium) می باشد مثل SIM  (sulfide-Indol-Motility )مدیوم که از آن می توان برای بررسی حرکت باکتری ها استفاده کرد.

محیط کشت مایع : (Fluid ) :

این نوع محیط کشت دارای پسوند براث (Broth) است و حالت جامد یا ژله ای ندارد از این نوع محیط می توان نوترین براث را نام برد.

انواع محیط کشت از نظر متمایز سازی:

محیط های کشت مختلف برای تشخیص و جداسازی باکتری ها به کار می روند بر چهار نوع اند:

۱-محیط های کشت عمومی(ساده):

این محیط ها دارای کلیه مواد لازم جهت رشد باکتری ها هستند و به علت نداشتن مواد ضد میکروبی تقریبا تمام باکتری ها می توانند در آن رشد کنند.محیط کشت نوترین آگار از این نوع محیط کشت است.

۲-محیط های کشت غنی شده:

این محیط ها به واسطه اضافه کردن خون یا سرم به محیط های کشت ساده فراهم می شوند.این محیط ها می توانند رشد یک سری باکتری های پر نیاز را فراهم کنند مثل محیط بلاد آگار یا سرم لفلر که مورد اخیر جهت کشت باسیل دیفتری به کار می رود.

۳-محیط های کشت افتراقی:

این محیط ها به علت داشتن یک سری مواد ویژه و در عین حال ضد میکروبی باعث تمایز برخی از باکتری ها می شوند مانند محیط  ائوزین متیلن بلو(E.M.B ) و مک کانکی که حاوی لاکتوز و معرف های شیمیایی هستند و به همین علت باعث تمایز باکتری هایی می شوند که لاکتوز را تخمیر می کنند.همچنین محیط هایی  مثل سلینت F و تتراتیونات براث وجود دارند که رشد باکتری سالمونلا را در نمونه مدفوع افزایش داده و از رشد دیگر باکتری ها جلوگیری می نمایند.

۴-محیط های کشت اختصاصی (انتخابی):

این محیط ها فقط برای رشد باکتری های ویژه ای مناسبند مثلا در محیط کشت مانیتول سالت آگار (Manitol Salt Agar )که دارای قند مانیتول و مقدار زیادی نمک ۵/۷ درصد است فقط باکتری هایی قادر به رشد هستند که اولا مانیتول را تخمیر کنند ثانیا در مقابل غلظت زیاد نمک طعام مقاوم باشند مانند باکتری استافیلوکوک بیماری زا که تین توانایی را داراست.

اصول تهیه محیط کشت:

امروزه اکثر محیط های کشت مورد استفاده در میکروب شناسی به صورت پودرهای آماده وجود دارند که برای تهیه آنها باید طبق دستور مقدار معینی از هر محیط کشت را با مقدار مناسبی آب مقطر مخلوط کرد برای این منظور ابتدا مقدار لازم را در ارلن مایر می ریزیم و مقدار پودر مشخص شده را به تدریج در آن وارد می کنیم و هم می زنیم تا پودر گلوله نشود و به طور یکنواخت حل گردد.گاهی برای تهیه محیط های کشت لازم است مقادیر معینی از مواد مختلف را با مقدار مناسبی آب مقطر مخلوط کرد.در هر صورت در مواقعی که آگار در ترکیب محیط کشت وجود دارد باید آن را در محیط حل کرد به این منظور بعد از مخلوط کردن مقدار لازم پودر و آب ضروری است که مخلوط حاصل به حدود یک دقیقه جوشانده شود تا رنگ محیط کاملا شفاف گردد به این منظور می توان از بن ماری و یا شعله مستقبم باید محیط را مرتب به هم زد تا آگار ته نگیرد و نسوزد پس از آماده شدن محیط باید آن را توسط اتوکلاو سترون کرد.در مورد برخی از محیط های اختصاصی مثلا سالمونلا –شیگلا-آگار سترون کردن محیطط لازم نیست. اگر منظور تهیه محیط کشت در پلیت باشد محیط را در همان ارلن مایری که تهیه کرده ایم در داخل اتوکلاو به مدت ۱۵ الی ۲۰ دقیقه استریل می کنیم پس از بیرون آوردن ارلن حاوی محیط کشت از داخل اتوکلاو اجازه می دهیم تا دمای آن حدود بین ۴۵ تا ۵۰ درجه سانتی گراد کاهش یلبد سپس در کنار شعله با رعایت شرایط سترون به مقدار ۱۰ تا ۱۵ سی سی در هر پلیت تقسیم می کنیم و سپس سطح محیط داخل هر پلیت را به منظور از بین بردن حبابهای احتمالی هوا توسط شعله تیز شعله دهی می کنیم.

برای تهیه محیط کشت در لوله آزمایش باید پس از مخلوط کردن و حرارت دادن مقدار پودر و آب مقطر مشخص در داخل ارلن محیط مذکور را در داخل لوله های آزمایش تقسیم نمود . معمولا تا ۱/۳ لوله ها را از محیط کشت پر می نمایند و سپس آنها را اتوکلاو می کنند.اگر منظور تهیه محیط آگار شیب دار باشد باید لوله ها را بعد از خارج کردن اتوکلاو به طور کج قرار داد تا محیط کشت بسته شود . برای تهیه محیط آگار تال (agartall ) مثل SIM لوله را به طور عمودی قرار می دهند تا محیط ببندد . در هر حال در تمام موارد باید دهانه لوله ها یا ارلن ها را قبل از اتوکلاو کردن خوب مسدود کرد و پنبه را به نحوی در دهانه لوله ها گذاشت که مقداری  از آن در داخل لوله و مقداری هم در بیرون قرار بگیرد به طوری که به راحتی بتوان آن را برداشت .(در هر صورت نباید آنقدر شل باشد که به آسانی بیفتد.) در نهایت محیط های پلیتی و لوله ای را به مدت ۲۴ ساعت قرار دادن در انکوباتور به منظور چک کردن آلوده بودن یا نبودن آنها به طور وارونه قرار می دهند . محیط ها را تا هنگام مصرف باید به طور وارونه در یخچال نگه داشت تا از تبخیر آب آنها جلوگیری شود.این محیط های کشت در صورت نگه داری در یخچال تا یک هفته قابل استفاده اند

روش تهیه محیط خون دار

برای تهیه محیط های خون دار از خون (دفیبرینه) خرگوش-گوسفند و … استفاده می شود ولی ترجیحا خون انسان نباشد .

۱-ابتدا مقدار لازم از محیط پایه بلاد را بر اساس دستورالعمل روی قوطی آن با مقدار لازم از آب مقطر مخلوط و اجازه دهید تا حدود ۱ دقیقه بجوشد

۲-این محیط را سترون سازید

۳- ۵تا ۱۰ درصد از خون مورد نظر را به محیط پایه بلاد بیفزایید.دمای محیط پایه در حدود ۴۵ تا ۵۰ درجه سانتی گراد باشد به طوری که دست را نسوزاند و آن قدر هم سرد نباشد که محیط ببندد

۴-مخلوط را تکان دهید تا کاملا حل شود

۵-محیط را در پلیت ها تقسیم کنید (با رعایت شرایط سترون سازی در مجاورت شعله)

از این محیط برای کشت باکتری هایی مثل استرپتوکوک و پنوموکوک که درانسان بیماری زا هستند استفاده می شود.

روش تهیه محیط ائوزین متیلن بلو (E.M.B )

۱-مقدار لازم از پودر ائوزین متیلن بلو را وزن کنید

۲-مخلوط را در ۱۰۰۰ سی سی آب کاملا حل کنید

۳-مایع به دست آمده را و سترون سازید

۴-محیط سترون شده را در پلیت ها تقسیم کنید . این محیط باید در طی یک هفته مورد استفاده قرار گیرد بر خلاف سایر محیط ها نمی توان آن را در ظروف و یا شیشه های کتابی بیش از یک هفته نگه داشت و پس از ذوب مجدد از آن استفاه کرد.این محیط دارای لاکتوز و معرف شیمیایی ائوزین متیلن بلو (جهت جلوگیری از رشد باکتری های گرم مثبت) است.به همین جهت باکتری های گرم منفی که لاکتوز را تخمیر می کنند در این محیط به رنگ قرمز تا سیاه ظاهر می شوند و باکتری های گرم منفی که لاکتوز را تخمیر نمی کنند کلنی هایی بی رنگ یا به رنگ محیط به وجود می آورند مثلا اشریشیا کلی در این محیط کلنی سیاه رنگ تولید می کند و روی پلیت سایه ای از رنگ سبز متالیک (جلای سبز رنگ)دیده می شود.

روش تهیه محیط S.I.M

۱-      مقدار لازم پودر مورد نظر را (طبق نوشته روی ظرف محتوی پودر )وزن کنید

۲-      پودر حاصل را در ۱۰۰۰ سی سی آب کاملا حل کنید

۳-      مایع حاصل را در لوله های آزمایش تقسیم کنید

۴-      دهانه لوله ها را به وسیله پنبه مسدود کنید

۵-      لوله ها را توسط اتوکلاو سترون کنید

۶-      لوله ها را پس از سترون کردن به طور عمودی قرار دهید تا محیط که نیمه جامد است بسته شود از این محیط جهت بررسی حرکت باکتری ها و قدرت تجزیه و آزاد سازی گوگرد توسط باکتری مورد نظر استفاده می شود

روش تهیه محیط نوترین آگار (N.A. ):

۱-مقداری گرم از پودر آماده را در ۱۰۰۰ سی سی آب حل کنید. (بر اساس دستورالعمل روی قوطی کشت)

۲-مایع حاصل را چند دقیقه بجوشانید تا رنگ محیط کاملا شفاف شود (برای این کار از حمام ماری ی شعله مستقیم استفاده کنید.در صورت استفاده از شعله مستقیم باید محیط را مرتب هم زد تا آگار ته نگیرد و نسوزد)

۳-محیط های تهیه شده را به وسیله اتوکلاو سترون کنید

۴-محیط تهیه شده را در پلیت ها تقسیم کنید

 از این محیط برای کشت اکثر باکتری ها استفاده می شود

محیط های پنج گانه (گالری افتراقی)

این محیط ها که در غالب موارد با هم استفاده می شوند در داخل لوله آزمایش تهیه می گردند و معمولا جهت شناسایی باکتری های خانواده انتروباکتریاسه از هم به کار می روند و شامل Triple Suger Iron Agar (T.S.I) , Sulfide Indo Motility Medium (S.I.M ) , SimmonCitar Agar (S.C ) , Urea Broth (U ) , Methyle Red VogesProskauer Broth (MR.VP   می باشد.

از این محیط دارای مشخصات خاصی هستند به طوری که محیط TSI قرمز رنگ و دارای سه قند گلوکز ,لاکتوز و سوکروز می باشد که به صورت دو قسمت عمقی (Butt ) و شیب دار (Slant ) تهیه می شود و جهت تشخیص قابلیت باکتری ها در استفاده از لین سه قند و تخمیر آنها (همراه با ایجاد گاز CO2 و یا بدون تولید آن ) و از طرفی تولید گاز H2S به کار می رود..تخمیر قندها به واسطه تولید اسید و زرد رنگ شدن محیط TSI مشخص می شود به طوری که اگر باکتری فقط قادر به تخمیر گلوکز باشد فقط قسمت عمقی و هم قسمت شیب دار زرد رنگ می شود.از طرفی تولید گاز CO2 به واسطه ایجاد حباب یا ترک خوردگی در محیط کشت یا بالا فرستادن محیط کشت مشخص می شود.محیط سیمون سیترات (S.C ) نیز محیطی است سبز رنگ و شیب دار که حاوی سیترات می باشد که اگر باکتری دارای آنزیم سیتراتازیا سیترات لیاز باشد با مصرف و تبدیل آن به کربنات سدیم رنگ محیط را از سبز به آبی تغییر می دهد.محیط SIM محیطی است نیمه جامد و زرد کم رنگ که به واسطه آن سه آزمایش تولیدH2S تولید اندول و حرکت باکتری ها مورد بررسی قرار می گیرد. این محیط فقط دارای عمق است و به صورت Stab کشت داده می شود.

تولید اندول به وسیله اضافه کردن چند قطره معرف کوآکس برسطح محیط SIM و تغییر رنگ معرف به صورتی تا بنفش نمایان می شود.حرکت باکتری نیز که در تشخیص انواع باکتری از آن استفاده می شود به واسطه وجود کدورت در اطراف محل ورود آنس در این محیط پس از ۲۴ ساعت مشخص می گردد.بررسی تولید H2S در محیط SIM آهن پپتونه است که مناسب تر از معرف سولفات آهن موجود در TSI است.محیط MR.VP نیز محیطی است مایع و به رنگ زرد کم رنگ که جهت دو تست متیل ردو ووگس پروسکوئر به کار می رود .برای تشخیص باکتری های تولید کننده ۳ و ۲ بوتانیدول ,آزمایش (VP ) به کار میرود ولیکن اساس آزمایش تشخیص ماده پیش ساز ۳ و ۲ بوتانیدول یعنی استوئین (استیل متیل کربینول) می باشد که طی واکنش هایی از گلوکز موجود در محیط (MR.VP ) حاصل می شود.

برای تشخیص باکتری های تولید کننده مخلوطی از اسیدها نظیر اسید لاکتیک ,اسید سوکسینیک و اسید فرمیک که از گلوکز موجود در محیط MR.VP حاصل می شوند آزمایش متیل رد MR.VP را که در زمان انکوباسیون آن طی شده در دو لوله تقسیم نمایید.به لوله اول معرف متیل رد MR) ) به میزان ۵/۰ سی سی اضافه کنید .تغییر رنگ محیط به قرمز نشان دهنده وجود اسید در نتیجه تخمیر قند گلوکز است .جهت انجام آزمایش VP نیز به لوله دوم ۶/۰ سی سی آلفانفتول و ۲/۰ سی سی پتاس ۴۰ درصد اضافه کنید.در صورت وجود استوئین رنگ محیط به صورتی مایل به قرمز تغییر رنگ پیدا می کند.محیط اوره نیز محیطی است به رنگ به رنگ نارنجی روشن پوست پیازی که به صورت مایع است و به منظور شناسایی باکتری هایی به کار می رود که دارای آنزیم اوره آز هستند که به واسطه این آنزیم می توانند اوره موجود در محیط کشت را به آمونیاک (NH3 ) تبدیل نمایند. در این صورت رنگ محیط کشت به واسطه قلیایی شدن محیط به رنگ صورتی تا قرمز در می آید.

رنگ آمیزی کپسول باکتری

مقدمه

بعضی از باکتریها ماده لزجی از خود ترشح می کنند که خارج از سلول و پیرامون آن جمع می شود و دیواره سلولی رامی پوشانداین لایه کپسول نامیده می شود که ضخامتهای متفاوت و چسبندگی متغیر دارد. اندازه کپسول به محیط کشت میکروبی بستگی داردو همچنین باکتریهای بیماریزا ، در بین باکتریهای تولید کننده کپسول ، کپسولهای بزرگتری دارند. جنس این کپسول از پلی ساکارید است که در آب محلول و غیر یونی است .

کاربرد کپسول در باکتریها :

کپسول بعنوان یک سد اسمزی بین باکتری و محیط اطراف آن عمل می کند و در واقع  نقش حفاظتی دارد. کپسول مانع از عمل بیگانه خواری گلبولهای سفید می شود همچنین بعنوان مخزن ذخیره مواد غذایی یا دفع مواد زائد هم می تواند عمل کند.

در تعدادی از باکتریهای بیماریزا ، وجود کپسول شدت بیماریزایی و عفونت زایی را افزایش می دهد و ممکن است حتی این بیماریزایی به وجود کپسول بستگی داشته باشد . مثلا در استرپتوکوکوس پنومونیا اگر توانایی تولید کپسول در باکتری از بین برود این باکتری غیر بیماریزا می شود.

در عمل رنگ آمیزی شرط رنگ گیری یک سلول یونی بودن آن می باشد یعنی وقتی سلول حالت یونی داشته باشد هنگام رنگ آمیزی بین نواحی یونیزه سطح سلول و اجزای یونیزه مولکولهای رنگ پیوند بوجود می آید . در نتیجه بین بارهای مخالف موجود در سطح سلول و مولکولهای رنگ پیوند یونی تشکیل می شود و باکتری رنگ می گیرد . اما چون کپسول را بعلت غیر یونی بودن آن نمی توان رنگ آمیزی کرد در نتیجه برای دیدن آن در زیر میکروسکوپ ، زمینه باکتری رنگ آمیزی می شود و در نتیجه امکان دیدن کپسول باکتری که بصورت بیرنگ ظاهر می شود ، فراهم می شود. این روش را رنگ آمیزی منفی می نامند.

در این روش رنگ آمیزی برای تثبیت گسترش از حرارت استفاده نمی شود . چون در اثر حرارت ، باکتری در داخل کپسول از شکل طبیعی خود خارج می شود.

رنگ آمیزی کپسول : هدف از انجام این رنگ آمیزی، رنگ کردن کپسول باکتریایی است، بدین منظور برای مشاهده کپسول باکتریایی و رنگ آمیزی آن از یک باکتری دارای کپسول و یک باکتری فاقدکپسول استفاده می شود. کلبسیلانمونیا یک باکتری غیرمتحرک و کپسول دار با طول ۶-۶/٠ میکرومتر و به صورتهای تکی، جفتی و یا زنجیره های کوتاه مشاهده می شود. سلولهای این باکتری ها حاوی تمایز زیادی کپسول پلی ساکاریدی هستند و همین امر سبب ایجاد کلونی های موکوئیدی بزرگ از این باکتری ها می شود. بیش از ٨٠ آنتی ژن کپسولی در کلبسیلا یافت نشده است که در تعیین نوع مروتایپهای آن بسیار مفید است. کلبسیلا در ضایعات انسانی، نمونه های کلینیکی، آب، حبوبات وغلات، میوه ها و همچنین سبزیجات یافت می شوند. باکتری آلکالی ژنس دنتری نیکانس که توانائی احیای و را دارد . بسیاری از باکتریها مثل باسیلوس آنتراسیس «عامل سیاه زخم»، استرپتوکوکوس موتانس «عامل پوسیدگی دندان»، استرپتوکوکوس نمونیا «عامل ذات الریه» و قارچ کریپتوکوکوس نئوفرمانس «عامل کریپتوکوکوزیس» بوسیله یک لایه ژلاتینی محاصره و پوشیده شده اند که این لایه کپسول نامیده می شود. در آزمایشگاه های تشخیص طبی نشاندن وجود و حضور کپسول به منظور شناساسیی و تشخیص میکروارگانیسم بیماری زا و همچنین تعیین میزان و شدت بیماری حاصله از آن صورت می گیرد . برخی خصوصیات ساختاری کپسول مثل ضخامت کپسول در بین سویه های یک گونه باکتریایی کاملاً متفاوت است. ترکیباتی مانند پلی ساکاریدها، پلی پپتیدها و گلیکوپروتئین ها در ساختار تمام کپسول ها یافت می شوند. در اکثر موارد یک باکتری بیماری زا با ضخامت کپسول زیاد «کپسول ضخیم» نسبت به همان نوع باکتری فاقدکپسول و یا کپسول نازکتر از قدرت تهاجمی و بیماری زائی بیشتری برخوردار است، بنابراین کپسول از باکتری در برابر فعالیتهای فاگوسیتوزی سلولهای فاگوسیت بدن میزبان حفاظت می کند. حضور کپسول در اکثر اوقات بوسیله روشهای رنگ آمیزی از قبیل رنگ آمیزی منفی و جوهر هندی مشخص می گردد. ناحیه بی رنگ اطراف سلول باکتری احتمالاً مربوط به جدا شدن سلول از رنگ های احاطه کننده اطراف سلول در حین مرحله خشک کردن است. در روش برای شناسایی وجود و حضور کپسول ها عبارتند از : ١. روش رنگ آمیزی آنتونی «آنتونی جی آر باکتری شناس دانشگاه تگزاس در ایالت آستین در سالهای ١٩٣٠ بوده است» . ٢. روش رنگ آمیزی گراهام و ایوان در روش آنتونی از دو رنگ استفاده می شود، یکی رنگ اولیه و ابتدائی که کریستال ویولت است که محتویات باکتری و کپسولش صورتی تیره می شوند. برخلاف سلول کپسول غیریونی است و بنابراین رنگ به خود نمی گیرد. در این روش از سولفات مس به عنوان عامل رنگ برنده استفاده می شود. این ترکیب اضافه رنگ اولیه را از کپسول خارج می کند. در همین زمان سولفات مس بعنوان یک رنگ زمینه ای عمل می کند و به درون کپسول وارد شده و آن را به رنگ آبی کم رنگ یا صورتی در می آورد. در این فرآیند نمونه نبایستی بوسیله حرارت تثبیت شود زیرا این انقباض به صورت خودبخودی رخ می دهد ویک ناحیه شفاف را در اطراف باکتری بوجود می آورد که به اشتباه به جای کپسول در نظر گرفته می شود . رنگ آمیزی به روش آنتونی : در گوشه سمت چپ لام نام باکتری مورد نظر را که برای رنگ آمیزی آنتونی قرار است به کار ببریم می نویسیم. یک لوپ کامل از محیط کشت را برداشته و بروی اسلاید و لام قرار می دهیم و اجازه می دهیم که در دمای اتاق کاملاً خشک شود. لام را بروی راک رنگ آمیزی قرار داده و به مدت ٧-۴ دقیقه با کریستال ویولت رنگ آمیزی کرده، سپس بعد از رنگ آمیزی با سولفات مس لام را شستشو می دهیم. در مرحله بعد با کاغذ صافی لام را خشک می کنیم. در این مرحله با افزودن روغن ایمرسیون در زیر میکروسکوپ مشاهده می کنیم که کپسول یک هاله را در اطراف سلول تیره باکتری تشکیل داده است . روش تغییریافته رنگ آمیزی کپسول ( روش گراهام و ایوانس ) : با استفاده از الکل و پارچه تمیز لامی را که قرار است مورد استفاده قرار گیرد تمیز می کنیم. به میزان دو لوپ از محیط کشت را با مقدار ٢-١ قطره از جوهر هندی در یک انتهای لام با هم مخلوط می کنیم، سپس این ترکیب مخلوط به آرامی و آهستگی به سمت دیگر لام پخش و گسترده می نماییم تا یک لایه نازک تشکیل شود. نمونه را خشک می کنیم، بهتر است در هوای اتاق خشک شود. با استفاده از آب مقطر لام را شستشو داده اما باید مراقب بود که باکتریها روی لام پاک نشوند. به مدت یک دقیقه به آن کریستال ویولت اضاف می نماییم. دوباره با آب شستشو می دهیم ، سپس برای مدت زمان سی ثانیه با سافرانین رنگ آمیزی می کنیم. دوباره با آب شستشو داده و آنرا خشک می کنیم. چنان چه کپسول وجود داشته باشد باکتریهای صورتی تا قرمزرنگ در یک هاله شفاف قرار دارند و رنگ زمینه هم تیره و سیاه می شود .

روش کار در رنگ آمیزی کپسول :

۱- روی یک لام تمیز بمقدار مساوی از مرکب چینی و سرم فیزیولوژی را با هم مخلوط کرده و با لوپ (نوک آنس) مقدار کمی از کشت باکتری را به آن اضافه کنید ، سوسپانسیون را به آرامی و کاملا مخلوط کنید و گسترش را پخش کنید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود.

۱-  سطح گسترش را با آبی متیلن لوفلر بپوشانید و بگذارید ۳ دقیقه بماند . بعد رنگ اضافی را خالی کرده و بعد با آب مقطر آنرا شستشو دهید. در این هنگام ممکن است مقداری از گسترش نیز شسته شود و این جای نگرانی ندارد چون گسترش ضخیم است و حتما مقداری از آن برای مطالعه شما باقی می ماند.

۲-  لام را با زاویه ۴۵ درجه نگدارید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود . توجه داشته باشید که هیچگاه کاغذ خشک کن را روی آن نکشید.

اگر محیط مایع بود استفاده از سرم فیزیولوژی ضروری نیست .

هنگام مخلوط کردن کشت با مایع به آرامی هم بزنید تا آرایش باکتریها بهم نخورد.

طرز تهیه رنگها و محلولها :

۱- آبی متیلن لوفلر

- آبی متیلن                           ۳/.گرم

- اتانول۹۵%                        ۳۰سی سی

- آب مقطر                           ۱۰۰سی سی

رنگ را در اتانول حل کنید . آب مقطر را به آن اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را با استفاده از قیف از کاغذ صافی عبور دهید.

۲- سرم فیزیولوژی

- کلرور سدیم                       ۸۵/.گرم

- آب مقطر                         ۱۰۰سی سی

کلرور سدیم را در آب مقطر حل کنید.

میکروب شناسی خاک

مقدمه:

مواد زاید ناشی از انسان و جانوران و همچنین اندام های مختلف جانداران اعم از گیاه و جانور مستقیما وارد خاک شده و سبب حاصلخیزی آن می شوند .خاکهای حاصلخیز یکی از مراکز تجمع میکروارگانیسم ها هستند.انواع گوناگونی از باکتری ها ,قارچ ها ,جلبک ها ,ویروس ها ,پروتوزوئرها در خاک زندگ می کنند.تعداد تقریبی میکروارگانیسم های خاک با میزان مواد آلی موجود در آن ارتباط دارد.شمارش تعداد باکتری های خاک توسط میکروسکوپ تعداد تقریبی آنها را بیش از چند میلیون در هر گرم خاک نشان می دهد ولی چنانچه این شمارش در روی محیط کشت انجام شود تعداد آنها در حدود چند میلیون در هر گرم خاک محاسبه می شود.علت چنین اختلافی این است که نمی توان محیط کاملا مساعدی از نظر فیزیکی و شیمیایی تهیه کرد که کلیه ی باکتری های خاک قادر به رشد در آن باشند.به عنوان مثال میکروبهای بی هوازی در سطح سطح محیط های عادی در شرایط هوازی رشد نمی کنند یا آنکه باکتری های بی هوازی تثبیت کننده ی ازت و اکثر باکتری های تجزیه کننده ی سلولز در محیط آگار غذایی رشد نم کنند و همچنین باکتری های احیا کننده ی سولفاتها برای رشد به وجود سولفاتها و ماده ی آلی اکسید کننده نیاز دارند.

به طور کلی عوامل موثر بر جمعیت و نوع میکروارگانیسم های موجود در خاک عبارتند از:

۱-مقدار و نوع مواد غذایی

۲- دما

۳- اثر میکروارگانیسم ها بر یکدیگر

۴- رطوبت

۵- PH

6- عوامل بیرونی مثل سیل و انسان

۷- میزان هوای موجود در خاک

۸- وجود ریشه گیاهان در خاک

نقش میکروارگانیسم ها در تجزیه ی مواد آلی و تبدیل آن ها به مواد کانی قابل استفاده برای گیاهان عامل مهمی است که زندگی بدون آن امکان پذیر نیست.تغییراتی که میکروارگانیسم ها در مواد ایجاد می کنند باعث گردش عناصر در جهان زنده می شود.

روش انجام آزمایش:

۱-در ۹ لوله آزمایش ۹ سی سی آب ریخته شود سپس ۱ گرم از نمونه خاک را لوله اول وارد کرده آن را خوب مخلوط کنید سپس ۱ سی سی از مخلوط را  از لوله اول با پیپت سترون برداشته در لوله دوم بریزید.دقت کنید پیپت نباید داخل آب شود و از قسمت  بالای لوله پیپت را خالی کنید و سپس با یک پیپت دیگر از لوله دوم برداشته در لوله سوم بریزید و خوب به هم بزنید.پیپت را کنار گذاشته با پیپت های دیگر این عمل را تا لوله هفتم ادامه دهید.

۲- از هر یک از ۴ رقت آخر ۱ سی سی در پلیت های سترون بریزید و رقت آن را پشت پلیت بنویسید.

۳-از آگار ذوب شده که گرمای آن حدود ۴۵ درجه سانتی گراد است به هر پلیت ۱۰ سی سی اضافه کنید و با حرکات دورانی در جهت حرکت عقربه های ساعت و خلاف آن محیط را با این ۱ سی سی رقت مورد نظر خوب مخلوط کنید.

۴- بعد از سفت شدن محیط پلیت ها آنه را ۴۸ ساعت در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد قرار دهید و پس از این مدت پلیتی را که بین ۱۰ تا ۳۰۰کلنی دارد از بین رقتها انتخاب کنید و کلنی های آن را بشمارید و در ضریب رقت ضرب کنید .مثلا اگر پلیت چهارم حاوی ۲۰ کلنی باشد تعداد تقریبی باکتری های موجود در یک گرم خاک برابر است با:

۲۰ ×۱۰۰۰۰ =

میکروب شناسی آب

میکروب شناسی آب:

آبی که به صورت باران,تگرگ و برف بر سطح زمین می ریزد دارای میکروب های موجود در هواست .هنگام نزول باران مقدار قابل ملاحظه ای از میکروارگانیسم های هوا کاسته می شود.آب باران پس از شستن سطح خاک به طرف دریاچه ها و اقیانوس عا سرازیر می شود و میکروبهای هوا و خاک را با خود به طرف منابع طبیعی آب میبرد.آبی که از طبقات مختلف زمین عبور می کند و به قسمت های عمیق خاک میرود در مراحل مختلف اکثر میکروبهای خود را از دست می دهد. در حقیقت طبقات مختلف زمین مانند صافی عمل کرده جمعیت میکروبهای اینگونه آبها را کم می کنند.به طور کلی چون منشا آبهای مختلف با یکدیگر تفاوت دارند لذا نوع میکروارگانیسم های موجود در آنها نیز با هم متفاوت اند.

مباحث مختلف میکروب شناسی آب شامل میکروب شناسی اقیانوس ها ,دریاها,تالابها,حوضچه ها,نهرها,رودخانه ها,آب آشامیدنی و فاضلابهاست.

چون آب قادر به حمل میکروارگانیسم های مختلف است لذا می تواند یکی از عوامل مهم و اساسی مؤثر در بهداشت یک منطقه باشد.عوامل بیماریزا که توسط آب منتقل می شوند بیشتر در دستگاه گوارش بیماری تولید می کنند.عوامل بیماریزا در مدفوع افراد آلوده وجود دارند و چنانچه این عوامل در شرایطی از طریق فاضلاب ها با آب آشامیدنی تماس حاصل کنندباعث بروز بیماری در افراد سالم می گردد.آبی که فاقد میکروارگانیسم های بیماری زا و مواد شیمیایی زیان آور باشد “آب آشامیدنی” و آبی که به وسیله فاضلاب آلوده شده باشد “آب آلوده ” خوانده می شود.

تشخیص آلودگی آب از نظر باکتری شناسی:

آبی که کاملا شفاف و بدون بو و طعم است ممکن است آلوده به میکروارگانیسم باشد.آزمایشهای باکتری شناسی برای تشخیص میزان آلودگی آب فقط مربوط به تشخیص عوامل بیماری زای موجود در آب نیستزیرا عوامل بیماری زا به  تعداد خیلی کم وارد آب می شوند و اکثراً پس از ورود به آب برای مدت طولانی قادر به ادامه زندگی نیستند .در نتیجه برای تشخیص آلودگی آب وجود گروهی از باکتری هاکه در حالت طبیعی در روده ی انسان و جانوران زندگی می کنند و به نام کلی فرم ها موسوم اند و همچنین استرپتوکوکوس فکالیس,کلاستریدیوم ولشی ای ,کلاستریدیوم پرفرژنس در آب جستجو می شوند.

تشخیص انواع ذکر شده در آب دلیل بر آلودگی آن توسط مدفوع است و از طرفی چون عوامل بیماری زا از طریق مدفوع افراد آلوده وارد آب می شوند,وجود و تشخیص انواعی از باکتری ها مانند کلی فرم ها در آب دلیل بر آلودگی آب توسط مدفوع است.انتخاب کلی فرم ها به ویژه گونه اشریشیاکلی به عنوان شاخص آلودگی به این علت است که این باکتری در روده ی آدمی به تعداد زیادی وجود دارد و در مقایسه با انواع باکتری های بیماری زا مدت طولانی تری در آب زنده می ماند.کلی فرم ها گروهی از باسیل های گرم منفی بدون هاگ هوازی یا بی هوازی اختیاری و تولید کننده ی گاز در محیط واجد لاکتوز هستند.نمونه های اصلی این گروه از باسیل ه عبارتند از اشریشیا کلی و انتروباکتر آئروژنز.

برای تشخیص آلودگی آب وهنگام نمونه برداری رعایت نکات زیر ضروری است:

۱-      نمونه ها باید تحت شرایط سترون و در بطری های سترون گرفته شوند

۲-      نمونه ها باید معرف مخزنی باشند آب از آن مصرف شده است

۳-      هنگام نمونه برداری باید دقت شود آلودگی اضافی رخ ندهد

۴-      جهت از بین بردن (خنثی کردن ) کل موجود در آب باید در داخل بطری نونه گیری قبل از استریلآن مقداری کریستال تیوسولفات سدیم ریخت

۵-      نمونه ها باید هرچه زودتر پس از جمع آوری مورد آزمایش قرار گیرند و چنانچه آزمایش آب با تأخیر همراه باشدنمونه ها باید در دمای بین صفر تا ۱۰ درجه سانتی گراد نگه داری شوند.

آزمایش های باکتری شناختی که جهت تشخیص آلودگی آب انجام می شود عبارتند از:

۱-      آزمایش برای تشخیص کلی فرم ها در آب

۲-      شمارش تعداد باکتری های موجود در آن

شمارش تعداد باکتری ها در آب:

روش کار:

۱-      برای شمارش تعداد باکتری ها در آب دو نمونه آب لوله کشی و آب نهر را انتخاب کرده

۲-      در مورد آب نهر آن را تا رقت ⁵ ̄ ۱۰ رقیق کنید و آب لوله کشی را بدون رقیق کردن مورد استفاده قرار دهید

۳-      از آب های مورد استفاده روی پلیت ها کشت می دهیم و پلت ها را ۴۸ ساعت در گرمخانه ی ۳۵ درجه سانتی گراد بگذارید سپس به بررسی و شمارش تعداد کلنی ها یا تعداد باکتری های موجود در ۱ سی سی از آب بپردازید.

از روی تعداد کلی باسیل های موجود در آب آبها را به سه دسته زیر تقسیم می کنند:

الف – آب بسیار خوب که در هر ۱۰۰ سانتی متر مکعب آن کمتر از یک اشریشیا کلی وجود دارد

ب – آب خوب که در هر ۱۰۰ سانتی متر مکعب آن یک تا دو اشریشیاکلی وجود دارد

ج – آب مشکوک که در هر ۱۰۰ سانتی متر مکعب آن بیش از ۱۰ اشریشیاکلی وجود دارد

تشخیص کلی فرم ها در آب:

برای شناسایی و شمارش کلی فرم ها محیط های انتخابی و افتراقی و روش خاصی لازم است.به این منظور دو روش اساسی شناخته شده است: الف – روش MPN (Most probable Number ) ب – روش فیلتر غشایی

الف – روش MPN :در این روش کلی فرم ها را در چند مرحله شناسائی می کنند: ۱- مرحله احتمالی ۲- مرحله تأییدی ۳- مرحله تکمیلی. در مرحله احتمالی رقت هایی از نمونه آب را به لوله های محتوی آبگوشت لاکتوز دار و معرف PH (لاکتوز فنل رد براث ) اضافه کرده و آنها را تا ۲۴ الی ۴۸ ساعت در گرمخانه قرار می دهند.تخمیر لاکتوز به اسید و گاز نشانه مثبت بودن واکنش است. در آزمایش احتمالی متداول در ۱۵ لوله حاوی محیط کشت نمونه آب را کشت میدهند (در هر یک از ۵ لوله اول ۱۰ میلی لیتر ,در ۵ لوله دوم یک میلی لیتر و در ۵ لوله سوم ۱/۰ میلی لیتر) .اگر اسید و گاز در هیچ یک از لوله ها پیدا نشود آب از نظر بهداشتی رضایت بخش در نظر گرفتته می شود و از نظر آماری این حالت نشانگر کمتر از ۲/۲ کلی فرم در هر ۱۰۰ میلی لیتر آب است .

هرگاه یک سری از لوله ها در آزمایش احتمالی نتیجه مثبت نشان دهند,تست اضافی انجام می گیرد زیرا میکروب های دیگری غیر از کلی فرم ها می توانند لاکتوز را با تولید گاز تخمیر نمایند. در آزمایش تأییدی از لوله های مثبت برداشت کرده و بر روی محیط افتراقی (ائوزین متیلن بلو آگار ) به طور خطی کشت می دهند.با توجه به اینکه کلی فرم ها از لاکتوز اسید تولید می کنند لذا کلنی هایی با مرکز تیره رنگ ایجاد می کنند .در عین حال اشریشیاکلی کلنی های بزرگ با مرکز تیره رنگ با درخشندگی ویژه,متمایل به سبز ایجاد می کند که علت ایجاد این درخشندگی یا جلای فلزی سبز ,آزاد شدن آزاد شدن ائوزین از محیط E.M.B و اکسید شدن آن در مجاورت هواست .ائوزین در محیط به صورت ترکیب با سولفیت سدیم است.در اثر رشد اشریشیاکلی از تخمیر لاکتوز ماده حدوسطی از جنس استالدئید تشکیل می شود که این ماده با سولفیت سدیم ترکیب شده سبب آزاد شدن معرف ائوزین می گردد.

پیدایش این نوع کلنی ها نشانگر مثبت بودن آزمایش تأییدی است.در آزمایش تکمیلی تک تک کلنی ها را از محیط تأییدی برداشت کرده و در آبگوشت لاکتوز دار و همچنین در محیط TSI ,24 ساعت در ۳۵ درجه قرار می دهند.هرگاه در این محیط ها اسید و گاز ایجاد شود و کلنی جدا شده گرم منفی , میله ای شکل و بدون اسپور باشد نتیجه آزمایش تکمیلی را مثبت اعلام می کنند.

ب)کلی فرم ها را همچنین می توان با روش فیلترهای غشائی نیز شناسایی کرد. بدین ترتیب ۱۰۰ میلی لیتر از آب مورد آزمایش را از فیلتر غشائی که قطر منافذ آن ۴۵/۰ میکرون است عبور می دهند.باکتری ها بر سطح فیلتر باقی می مانند,آنگاه پالایه را بر روی محیط کشت قرار می دهند.باکتری های کلی فرم بر روی فیلتر آغشته به ماده غذایی کلنی هایی مشخص رشد می کنند.هرگاه فقط یک کلنی از این ۱۰۰ میلی لیتر آب رشد کند آب را معمولاٌ از نظر آشامیدن سالم و بهداشتی می شناسند.

انواع رنگ آمیزی میکروب ها(رنگ آمیزی ساده,افتراقی,مخصوص)

انواع رنگ آمیزی میکروب ها:

یکی از مشخصات مهم باکتری ها که به شناسایی آنها کمک می کند رنگ پذیری آنها با رنگ های مختلفی است که برای این منظور به کار می روند.این رنگ ها یا رنگ های عمومی هستند یعنی همه ی باکتری ها را یکسان رنگ می کنند و یا رنگ های اختصاصی که فقط یک گروه از باکتری ها را به رنگ خاص درمی آورد.

مورفولوژی باکتری ها را می توان به دو صورت مورد بررسی قرار داد یکی به صورت زنده که یا از رنگ استفاد نمی شود و یا از رنگ های حیاتی مثل قرمز خنثی برای رنگ آمیزی باکتری ها استفاده می شود و دیگری به صورت مرده یا به عبارتی فیکس شده که از رنگ ها و روش های مختلفی برای رنگ آمیزی گسترش باکتری استفاده می شود.

تقسیم بندی رنگ ها:

رنگ ها از نظر نوع ترکیب مواد رنگی به دو گروه رنگ های ساده و رنگ های مرکب تقسیم می شوند.

الف)رنگ های ساده:این دسته از رنگها از یک ماده ساخته شده اند

ب)رنگ های مرکب:این گروه از رنگ ها از چند دسته مواد تشکیل شده اند

در تقسیم بندی دیگر رنگ ها را بر اساس میل ترکیبی آنها با اجزا یاخته تقسیم بندی می کنند. در رابطه با این امر رنگ ها از نظر گرایش به اجزا یاخته یا رنگ دوستی هسته و سیتوپلاسم به سه دسته تقسیم می شوند:

۱-      رنگ های بازی یا هسته ای : این رنگ ها اصولا یا DNA و یا RNA یاخته ترکیب می شوند.از انواع رنگ های بازی می توان کریستال ویوله , فوشین ,آبی متیلن و سبز متیل را نام برد.کریستال ویوله  که بار الکتریکی  مثبت دارد  به وسیله باکتری دارای بار الکتریکی منفی جذب می شود و آن را رنگ می کند.

۲-      رنگ های اسیدی :این رنگ ها شامل سافرانین و فوشین اسیدی و قرمز کنگو هستند و ترکیبات بازی یاخته و اصولاٌ پروتئین های بازی را رنگ می کنند.

۳-      رنگ های خنثی : سودان سیاه رنگی است که در چربی محلول است و غالباٌ برای مشخص کردن قطرات چربی و موقعیت آنها در باکتری ها به کار می رود.

در میکروب شناسی غالباٌ از سه نوع رنگ آمیزی استفاده می شود.

الف) رنگ آمیزی ساده

ب) رنگ آمیزی افتراقی

ج) رنگ آمیزی مخصوص

الف) رنگ آمیزی ساده :

در این نوع رنگ آمیزی از یک نوع رنگ استفاده می شود و از این روش می توان برای رنگ کردن کامل سلول یا ساختارهای ویژه آن استفاده کرد. آبی متیلن غالباٌ برای رنگ آمیزی ساده باکتری های فیکس شده  به کار می رود و آنها را به رنگ آبی در می آورد.از رنگ های دیگری چون کریستال ویوله و کربول فوشین نیز می توان برای رنگ آمیزی ساده استفاده نمود.گاهی یک رنگ ساده به عنوان رنگ منفی به کار می رود که در این ارتباط می توان به رنگ آمیزی منفی در رابطه با تشخیص کپسول اشاره نمود که زمینه رنگ می گیرد در حالی که کپسول بدون رنگ مشخص می شود.رنگ آمیزی ساده به دو روش می تواند انجام بگیرد:

الف-۱) رنگ آمیزی ساده به روش مثبت (آبی متیلن یا کریستال ویوله )

۱-      ابتدا توسط یک لوپ پلاتینی از کلنی یا سوسپانسیون باکتری های موجود یک گسترش بیضی شکل بر روی یک لام تمیز و غیر چرب تهیه نمایید و سپس تا گسترش مذکور در مجاورت هوا خشک شود. گسترش خشک شده را با عبور دادن لام طی ۲ تا ۳ بار از میان شعله فیکس نمایید.هدف از فیکس کردن گسترش چسباندن محکم باکتری های موجود در گسترش به سطح لام می باشد. که این امر به واسطه انعقاد قسمتی از پروتئین های باکتریایی فراهم می گردد. این امر از شسته شدن گسترش در حین رنگ آمیزی جلوگیری می کند.

۲-      چند قطره از محلول رنگی آبی متیلن را روی گسترش میکروبی ریخته و پس از دو دقیقه آن را با آب مقطر بشویید.

۳-      اجازه دهید تا لام در مجاورت هوا خشک شود.پس از آن در زیر میکروسکوپ به مطالعه ی آن بپردازید.

الف-۲) رنگ آمیزی ساده به روش منفی (مرکب چین یا نگروزین )

همانطوری که قبلاٌ اشاره شد غالباٌ از این روش جهت تشخیص کپسول استفاده می شود که روش آن به ترتیب زیر است:

۱-      ابتدا مقداری از نمونه باکتریایی را در یک لوله آزمایش یا حجمی برابر با مرکب چین یا نگروزین مخلوط نمایید.

۲-      توسط لوپ مقداری از این سوسپانسیون را بر روی لام گذارده و یک گسترش از آن تهیه نمایید.

۳-      اجازه دهید تا گسترش خشک شود سپس توسط میکروسکوپ به مطالعه آن بپردازید در این رنگ آمیزی کپسول با کتری به صورت یک هاله بی رنگ در زمینه تیره مشخص می شود

ب) رنگ آمیزی افتراقی:

رنگ آمیزی است که باکتری های مختلف در برابر آن واکنش مختلفی نشان می دهند و از این طریق می توان آنها را طبقه بندی و مورد شناسایی قرار داد . بهترین روش رنگ آمیزی افتراقی در باکتری شناسی رنگ آمیزی گرم می باشد.

این رتگ آمیزی در سال ۱۸۸۴ توسط پزشک دانمارکی کریستین گرم ابداع گردید. در این رنگ آمیزی باکتری ها به دو گروه تقسیم می شوند: باکتری های گرم مثبت که به رنگ بنش ظاهر می شوند و باکتری های گرم منفی که به رنگ صورتی نمایان می شوند.

در این رنگ آمیزی کریستال ویوله به عنوان رنگ اولیه عمل می کند نمایان می شوند.

در این رنگ آمیزی کریستال ویوله به عنوان رنگ اولیه عمل می کند و به دیواره سلولی باکتری متصل می شود.این اتصال به واسطه کمپلکسی که با (ید) لوگل ایجاد می کند تثبیت می گردد, در واقع ید به عنوان یک موردانت عمل می کند چرا که میل ترکیبی یا جاذبه بین سلول و رنگ را افزایش داده و به نحوی به تثبیت رنگ روی سلول کمک می کند.برخی از گونه های باکتریایی این توانایی را دارند که حتی پس از اضافه کردن رنگ بر ( الکل یا استن ) رنگ کریستال ویوله را حفظ می کنند لذا در رنگ آمیزی گرم به رنگ بنفش در می آیند. این امر به آن علت است که در دیواره باکتری های گرم مثبت ضخیم بودن لایه پپتیدوگلیکان و کم بودن مقدار چربی مانع از نفوذ الکل به دیواره و در عین حال مانع از خروج رسوب رنگی از دیواره می گردد. این در حالی است که دیواره ی سلولی باکتری های گرم منفی به علت وجود مقادیر زیاد چربی و نازک تر بودن لایه پپتیدوگلیکان پس از اضافه نمونه رنگ بر رنگ کریستال ویوله را از دست می دهد و در این موارد بعد از اضافه کردن سافرانین در مرحله آخر به رنگ صورتی در می آیند

ب – ۱) رنگ آمیزی گرم به روش هوکر(Hucker )

1-      ابتدا از باکتری مورد نظر یک گسترش نازک تهیه کرده و در هوای آزمایشگاه اجازه دهید تا خشک شود.

۲-      گسترش مذکور را فیکس کنید

۳-      کریستال ویوله را به مدت ۱ دقیقه روی لام قرار دهید

۴-      لام را با آب مقطر شستشو دهید

۵-      محلول لوگل را به مدت ۱ دقیقه روی لام اثر دهید

۶-      لام را با آب شستشو دهید

۷-      از محلول ۲۵ درصد سافرانین به مدت ۲۰ ثانیه بر روی لام استفاده کنید

۸-      لام را با آب مقطر شسته و پس از خشک شدن آن در زیرر میکروسکوپ به مطالعه آن بپردازید

باید دانست که شرایط محیط (مانند PH ,مواد غذایی ,سن باکتری) در رنگ پذیری باکتری ها موثرند.برخی از باکتری های گرم مثبت پس از چند روز رشد در محیط غذایی ممکن است در رنگ آمیزی گرم به صورت گرم منفی درآیند همچنین اگر مدت زمان استفاده از رنگ بر زیاد شود ممکن است باکتری های گرم مثبت رنگ اولیه خود را از دست بدهند و به رنگ صورتی درآیند.

ج)رنگ آمیزی مخصوص

از رنگ آمیزی مخصوص جهت مشاهده و بررسی برخی باکتری های خاص و اجزاء داخلی و جانبی آنها استفاده می شود.در این بخش به رنگ آمیزی های خاصی چون زیل نلسون ,لیفسون,شیفر فولتون و آلبرت می توان اشاره نمود

(ج – ۱ ) رنگ آمیزی زیل نلسون

برخی از باکتری ها (باسیل سل ,,جذام و برخی از جنس های نوکاردیا )به واسطه دارا بودن میزان بالایی از چربی به آسانی به روش های معمولی رنگ آمیزی نمی شوند بلکه برای این امر به یک رنگ و حرارت قوی و زمان بیشتری جهت نفوذ رنگ به داخل پیکرشان نیاز دارند.به واسطه این نوع رنگ آمیزی این باکتری ها حتی توسط اسیدهای معدنی و یا اسید الکل رنگ زدایی نمی شوند که به همین جهت واژه اسید فست به آنها اطلاق می گردد.این خاصیت اجاززه می دهد که باکتری ها حتی به تعداد کم در گسترش رنگ شده قابل تشخیص باشند.ترتیب رنگ آمیزی زیل نلسون به قرار زیر است:

۱-      یک گسترش ضخیم و یکنواخت از نمونه تهیه و آن را در هوا خشک کرده و سپس توسط شعله فیکس نمایید.

۲-      یک کاغذ صافی به ابعاد ۲*۴ سانتی متر یا کمی کوچکتر از لام فراهم کنید.این کاغذ بایستی اسمیر (گسترش ) را بپوشاند تا از رسوب رنگ روی جلوگیری کند.

۳-      تمام سطح گسترش را با کربول فوشین (رنگ بازی ) زیل نلسون بپوشانید و به آرامی از سطح زیرین لام توسط شعله حرارت دهید.در زمان حرارت دادن لام بایستی میزان حرارت آنقدر باشد که سطح لام فقط بخار بلند شود و نبایستی رنگ روی لام بجوشد و یا خشک شود در صورتی که به علت حرارت و بخار شدن رنگ میزان رنگ کاهش یابد می توان مجددا روی لام رنگ اضافه کرد

۴-      زمان تأثیر رنگ روی گسترش ۵ دقیقه است بعد از آن کاغذ را برداشته و لام را با آب بشویید

۵-      توسط اسید الکل رنگ زدایی کنید یا از محلول مزبور آنقدر روی لام قطره قطره می ریزند تا آخرین قطره خارج شده از روی لام شفاف باشد.

۶-      از رنگ آبی متیلن به مدت ۳۰ تا ۶۰ ثانیه روی گسترش بریزید

۷-      لام را شسته در هوا خشک کنید و با عدسی روغنی به مطالعه پردازید

در این رنگ آمیزی باکتری سل به صورت باسیل ظریف و قرمز رنگی در زمینه آبی مشخص می شود

(ج – ۲) رنگ آمیزی تاژک به روش لیفسون

تاژک ها ضمائمی هستند بسیار شکننده که نسبت به حرارت حساس می باشند و جهت رنگ آمیزی باید با دقت فراوان با انها کار کرد و نیاز به روش های مخصوص می باشد . تاژک ها با میکروسکوپ های معمولی قابل مشاهده نیستند و به این منظور باید قطر انها افزایش یابد تا قابل رویت گردند.این عمل با استفاده از پوشاندن سطح آنها توسط یک ماده موردانت انجام می شود.این ماده اجازه می دهد تا مواد رنگی به خوبی روی آن تثبیت شده و ساختمان نخی شکل تازک بعد از رنگ آمیزی قابل مشاهده گردد.

۱-      برای رنگ آمیزی تاژک معمولا کشت ۱۸ الی ۲۴ ساعته باکتری بر روی محیط آگاردار مناسب می باشد که پس از مدت مذکور بر سطح محیط کشت ۲ تا ۳ میلی لیتر آب مقطر سترون ریخته و محلول را در لوله سترون بریزید و ان را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه قرار دهید و سپس از قسمت سطحی این سوسپانسیون برداشت کنید

۲-      رنگ تازه تهیه شده لیفسون را اختیار کنید

۳-      برای رنگ آمیزی روی لام مورد نظر یک مستطیل با ماژیک رسم کنید به طوری که ۳/۲ لام را شامل شود

۴-      ۱/۰ میلی لیتر از محلول باکتری را از سطح رویی سوسپانسیون میکروبی برداشته و در یک گوشه مستطیل روی لام قرار دهید

۵-      لام را با زاویه ۳۰ تا ۴۰ درجه کج کنید تا محلول از یک طرف لام به سمت دیگر برود لام را به حالت کج در دمای آزمایشگاه خشک کنید. این لام پس از خشک شدن نیازی به ثابت کردن ندارد

۶-      قسمت مستطیلی لام را کاملا با رنگ لیفسون بپوشانید و حدود۱۰ تا ۱۵ دقیقه صبر کنید

۷-      لام را با آب بشویید برای شستشو بهتر است آب را با پیپت به آرامی روی گسترش بریزید

۸-      لام را در دمای آزمایشگاه خشک کنید و آن را توسط عدسی روغنی مورد مطالعه قرار دهید در این حالت تاژک به رنگ صورتی کم رنگ و جسم باکتری پررنگ تر دیده می شود

یاد آوری : از نمونه موارد آزمایش می توانید قطره معلق نیز تهیه کنید تا از متحرک بودن کشت مطمئن شوید

(ج – ۳)رنگ آمیزی گرانول های ولوتین (دانه های متاکروماتیک ) به رو آلبرت

از این رنگ آمیزی جهت تشخیص باسیل کورینه باکتریوم (عامل بیماری دیفتری ) و دیگر اعضا کورینه باکتریوم ها استفاده می شود چرا که این باکتری ها در دیواره خود دارای دانه های متاکروماتیک هستند.ترتیب این رنگ آمیزی به شرح زیر است:

۱-      یک گسترش از باکتری مذکور تهیه و پس از فیکس نمودن آن از محلول A به مدت ۵ دقیقه بر روی آن اثر دهید

۲-      رنگ را از روی لام بدون شستشوی آن با آب دور بریزید

۳-      محلول B را روی لام به مدت ۱ دقیقه اثر دهید

۴-      لام را با آب شسته  در هوا خشک کرده و توسط عدسی روغنی به مطالعه بپردازید

در این آزمایش گرانول های متاکروماتیک در دو سر باکتری به رنگ سبز تیره تا سیاه و پیکر باکتری به رنگ سبز روشن مشاهده می گردند

محلول A  شامل :

آبی تولوئیدین ۱۵ صدم گرم,سبز مالاشیت ۲ صدم گرم,الکل اتیلیک ۹۵ درصد ۲ میلی لیتر ,آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

محلول B شامل :

یدور پتاسیم ۳ گرم ,ید ۲ گرم ,آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

رنگ آمیزی گرم

این روش رنگ آمیزی یکی از مهمترین ومتداولترین روشهای رنگ آمیزی درباکتری شناسی است که اولین بار توسط کریسین گرم ابداع شد . دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت وگرم منفی تقسیم می شوند . رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتیبه ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . دررنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری های گرم منفی به      رنگ قرمز مشاهده می شود

گرچه هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت یک لایه ضخیمی‌است از پپتیدوگلیکان، ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌رسد.

بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار پایدار است و در مرجله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.

از طرفی در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است بنابراین چربیها در الکل استن که در مرحله بعدی بعنوان رنگ بر بکار می روند ، محلول هستند و در اثر این واکنش چربیها از دیواره سلولی خارج شده و در اثر شستشو با حلال رنگ بر ، رنگ کریستال ویوله هم از سطح باکتری خارج می شود . با خروج چربی توسط ماده رنگ بر ، بر اندازه منافذ دیواره سلولی افزوده شده که این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتریهای گرم منفی می شود .در این مرحله باکتریهای گرم منفی از کریستال ویوله پاک می شوند . بنابراین بعد از شستشو توسط آب و افزوده شدن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) ، این رنگ به دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی جذب شده و باکتریها به رنگ قرمز در می آیند و در بررسی میکروسکوپی ، باکتریهای گرم منفی برنگ قرمز دیده می شوند.

اکثر باکتریهای موجود ، گرم منفی هستند البته بعضی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.

در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به ۵ گروه تقسیم بندی می کنند:

۱-        میله ای (باسیل ) گرم مثبت ۲- میله ای گرم منفی ۳- کوکوس (گرد) گرم مثبت ۴- کوکوس گرم منفی ۵- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.

در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این ۵ گروه قرار داده و با اطمینان ۴ گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .

خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :

۱-        باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.

۲-        گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.

۳-        باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .

۴-        باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و هضم و متلاشی شده آن می شوند.

 کاربرد رنگ آمیزی گرم

از رنگ‌آمیزی گرم به دو جهت استفاده می‌شود:

• شناسایی جنس باکتری
• انتخاب آنتی‌بیوتیک مناسب (باکتری‌های گرم مثبت در مقایسه با باکتری‌های گرم منفی نسبت به پنی‌سیلین G حسّاسیت بیشتری دارند(

با این حال همهٔ باکتری‌ها را نمی‌توان با رنگ‌آمیزی گرم مشاهده نمود

روش انجام  آزمایش:

۱- رنگ کریستال ویوله رابه مدت ۳۰تا۴۵ ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها بهرنگ بنفش درخواهد درآمد

۲- پس از شستشو گسترش با آب به مدت ۳۰تا۴۵ ثانیه بالوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند .

مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد  . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .

۴- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا۴۵ ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .

میکروب ها باهوش هستند

                                 

بسیاری از باکتری ها و آغازیان رفتارهای هوشمندانه و قابل ملاحظه ای از خود نشان می دهند. این رفتارهای هوشمندانه، از آن نوع که در انسان و یا سایر موجودات پیچیده می بینیم، نمی باشد چرا که موجودات تک سلولی نه تنها مغز، بلکه سیستم عصبی هم ندارند. به عبارت دیگر آنها کامپیوترهای زیستی هستند که می تواند اطلاعات را پردازش کند. در این مطلب به چندین مثال برجسته از این رفتارهای هوشمند اشاره می کنیم. بخش اعظم گونه های موجود بر روی زمین تک سلولی هستند. بسیاری از این موجودات تک سلولی تا کنون شناخته نشده اند و بسیاری از آنهایی هم که شناسایی شده اند، نام گذاری نشده اند. اما بخش کوچکی از گونه های تک سلولی که تا به حال مورد مطالعه قرار گرفته اند، توانایی های قابل ملاحظه ای از خود نشان داده اند. بسیاری از این توانایی ها فیزیکی هستند؛ به طور مثال، برخی از آنها می توانند برای صدها هزار سال غیر فعال باشند و یا در محیطی رشد کنند که سایر میکروارگانیسم ها بلافاصله در آن از بین می روند. بسیاری از باکتری ها و آغازیان رفتارهای هوشمندانه و قابل ملاحظه ای از خود نشان می دهند و به نظر می آید آنها کامپیوترهای زیستی هستند که می تواند اطلاعات را پردازش کند. در اینجا به چندین مثال برجسته از این رفتارهای هوشمند اشاره می کنیم. ارتباطات باکتری ها بوسیله مواد شیمیایی با یکدیگر ارتباط برقرار می کنند. آنها این کار را به دلایل مختلفی انجام می دهند که درک آن مشکل است. یکی از ساده ترین این باکتری ها باسیلوس سوبتیلیس می باشد. اگر باسیلوس سوبتیلیس در محیط فقیر مواد غذایی رشد کند، ماده شیمیایی خاصی به اطراف خود ترشح می کند. این ماده به باکتری های اطراف می گوید “غذای کافی اینجا وجود ندارد، از اینجا بروید وگرنه هردو از گرسنگی خواهیم مرد”. در جواب به پیغام این مواد شیمیایی، سایر باکتری ها با فاصله از یکدیگر قرار گرفته و شکل کلنی ها کاملا تغییر می کند. تصمیم گیری بسیاری از موجودات تک سلولی، قادر به شناسایی تعداد باکتری های هم گونه خود که در نزدیکی آنها قرار دارند هستند. این توانایی به “حس حد نصاب” (quorum sensing) معروف است. هر باکتری مقدار کمی از یک ماده شیمیایی را به محیط اطرافش ترشح می کند که می تواند توسط گیرنده¬های موجود در دیواره سلولی آنها تشخیص داده شود. اگر تعداد زیادی باکتری در محیط باشد، تمام باکتری ها یک نوع ماده شیمیایی ترشح کرده و میزان این ماده شیمیایی به نقطه بحرانی رسیده و سبب تغییر در رفتار باکتری ها می شود. باکتری های بیماری زا اغلب با استفاده از این حس، تصمیم می گیرند چه زمانی به میزبان خود حمله کنند. زمانی که به تعداد کافی برای فشار به سیستم ایمنی تکثیر شدند، به صورت دسته جمعی حمله به موجود میزبان را آغاز می کنند. بنابراین، به نظر می آید با جلوگیری از انتقال علائم بین این باکتری ها می توان راهی را برای مقابله با آنها پیدا کرد. شهر نشینی (تشکیل جوامع باکتریایی) باکتری ها نه تنها می توانند با یکدیگر ارتباط برقرار کنند و با هم همکاری داشته باشند بلکه می توانند تشکیل جوامعی را بدهند. نتیجه این کار، بیوفیلم یا همان لایه های نازک لعابی شکل داخل لوله های آب، یا سطوح آشپزخانه در خانه های دانشجویی(!) می باشد. آنها همچنین در پناهگاه های زیستی مانند لایه داخلی دستگاه گوارش انسان و یا هرجایی که آب وجود داشته باشد یافت می شوند. بسیاری از گونه ها در کنار یکدیگر در “شهرهای باکتریایی” از مواد زائد یکدیگر استفاده می کنند و از منابع غذایی با همکاری یکدیگر بهره برداری کرده و از یکدیگر در مقابل خطرات خارجی مانند آنتی بیوتیک ها محافظت می نمایند. تسریع در جهش زایی بسیاری از میکروب ها قادر به سرعت بخشیدن به میزان جهش در ژن های خود هستند. این امر به آنها توانایی های جدیدی می بخشد که می تواند برای شرایط سخت مفید باشد. این امر از آنجایی که بسیاری از جهش ها مضر و حتی کشنده می باشند، برای باکتری خطرساز است و به عنوان آخرین راه حل و زمانی که چیز زیادی برای از دست دادن باقی نمانده است، استفاده می شود. مثال های زیادی در این زمینه وجود دارند: اشریشیا کلی بسیار سریع تر در شرایط استرس جهش می یابد و نشان داده شده است که مخمر هم از همین ترفند استفاده می کند. در اوایل دهه ۹۰ میلادی، محققین پیشنهاد دادند که باکتری ها ممکن است راه خاصی برای انتخاب جهش ها داشته باشند. در این زمینه ایده جهش مستقیم (directed mutation) بسیار بحث برانگیز بود. جهت یابی بسیاری از جانوران می توانند از فواصل زیادی راه خود را پیدا کنند. پرنده هایی که کوچ می کنند و زنبور عسل بهترین مثال ها برای این پدیده هستند. میکروب ها نیز در این زمینه تبحر دارند. جلبک های تک سلولی که به شکل دسته جمعی کلامیدوموناس نام دارند، به سمت نور شنا می کنند البته فقط زمانی که آن نور در طول موجی باشد که آنها برای فتوسنتز از آن استفاده می کنند. مشابه جلبک های تک سلولی، بعضی از باکتری ها به سمت مواد شیمیایی که در محیطشان وجود دارد، حرکت می کنند که به این رفتار کموتاکسیس می گویند. برای مثال اشریشیا کلی همانند کوسه ای که رد خون را می گیرد، اگر حتی مولکول های اندکی از غذا وارد محیط اطرافش شود، به سمت آن حرکت می کند. گروه دیگری از باکتری ها به طرف نیروی مغناطیسی زمین به گونه ای صف می شوند که قادر به حرکت مستقیم به سمت شمال یا جنوب شوند. این باکتری ها که معروف به باکتری های مغناطیسی هستند، این توانایی ویژه را از اندامک های پوشیده شده از کریستال های مغناطیسی خود کسب نموده اند. اما شاید بهترین مثال از جهت یابی میکروب ها، کپک پلی سفالوم (Physarum polycephalum) باشد. کلنی های شبه آمیب این موجود، همیشه کوتاهترین راه را در یک مسیر پیچیده انتخاب می کنند. یادگیری و حافظه وقتی آمیب Dictyostelium سطحی را برای غذا جستجو می کند، گاهی تغییر مسیر داده و بر می گردد ولی این تغییر مسیرهایش تصادفی نمی باشد. این موجود با تغییر جهت های هدفمند، آخرین چرخش خود در مسیر را به خاطر می سپارد. اسپرم انسان نیز دارای چنین توانایی می باشد. اشریشیا کلی حتی بهتر از این عمل می کند. این باکتری بخشی از چرخه زندگی خودش را صرف گشت و گذار در دستگاه گوارش و روبرو شدن با محیط های مختلف می کند. در طی این مدت، با قند لاکتوز قبل از یافتن قند مرتبط با آن یعنی مالتوز مواجه می شود. در مواجهه با لاکتوز، سازوکار بیوشمیایی تجزیه این قند فعال می شود اما در همین حال، سیستم تجزیه مالتوز نیز تا حدودی فعال می شود تا برای مرحله بعد که برخورد با مالتوز می باشد، آماده باشد. اما در تحقیقات دانشمندان اسرائیلی، پژوهشگران این باکتری را برای چندین ماه در محیط کشت واجد لاکتوز و بدون مالتوز، رشد دادند. آنها متوجه شدند که این باکتری به تدریج رفتارش را تغییر داده و تمایلی به فعال کردن سیستم تجزیه مالتوز نشان نمی دهد. ترجمه: سمانه مفاخری ویرایش: کسری اصفهانی منبع: نیوساینتیست

رنگ آمیزی و ازمون گرم

معروفترین نوع رنگ آمیزی مرکب نوع گرم می باشد . این روش مفیدترین روش تشخیص باکتریها می باشد.

میکروبشناسی بنام کریستیان گرم در سال ۱۸۸۴ بطور تصادفی واکنشی را کشف کرد که بعدها واکنش رنگ آمیزی گرم نامیده شد.

بر این اساس باکتریها با توجه با ساختمان دیواره یاخته ای (سلولی) به دو بخش بزرگ و کلی تقسیم می شوند: باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی . تفاوت عمده بین این دو گروه تفاوتهای ساختاری(ساختمانی) بین این دو گونه می باشد به این ترتیب که در گونه گرم مثبتها در دیواره سلولی نوعی پلی ساکارید بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی ضخیمتر می باشد در صورتیکه در دیواره سلولی نوع گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی نازکتر از نوع گرم منفی می باشد.

بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار پایدار است و در مرجله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.

از طرفی در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است بنابراین چربیها در الکل استن که در مرحله بعدی بعنوان رنگ بر بکار می روند ، محلول هستند و در اثر این واکنش چربیها از دیواره سلولی خارج شده و در اثر شستشو با حلال رنگ بر ، رنگ کریستال ویوله هم از سطح باکتری خارج می شود . با خروج چربی توسط ماده رنگ بر ، بر اندازه منافذ دیواره سلولی افزوده شده که این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتریهای گرم منفی می شود .در این مرحله باکتریهای گرم منفی از کریستال ویوله پاک می شوند . بنابراین بعد از شستشو توسط آب و افزوده شدن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) ، این رنگ به دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی جذب شده و باکتریها به رنگ قرمز در می آیند و در بررسی میکروسکوپی ، باکتریهای گرم منفی برنگ قرمز دیده می شوند.

اکثر باکتریهای موجود ، گرم منفی هستند البته بعضی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.

بنابراین مراحل رنگ آمیزی گرم را می توان به شرح زیر بیان نمود:

۱-        تهیه گسترش روی لام : ابتدا از نمونه باکتری  یک گسترش روی لام تهیه می کنید.

۲-        رنگ آمیزی با کریستال ویوله : در این مرحله مقداری از رنگ کریستال ویوله را با قطره چکان به روی سطح گسترش میکروبی روی لام بریزید و بگذارید ۱ دقیقه بماند تا رنگ در دیواره سلولی میکروبها نفوذ کند.

۳-        مرحله شستشو: پس از سپری شدن مدت زمان ۱ دقیقه ، رنگ اضافی روی لام را خالی کرده و با استفاده از آب مقطر سطح روی گسترش را شستشو دهید.

۴-        مرحله اضافه کردن محلول ید : جند قطره از محلول ید را روی گسترش پخش نموده و بگذارید بمدت ۱ دقیقه به همان حالت بماند . بعد محلول اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.

۵-        مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل : لام را با زاویه ۴۵ درجه نگهدارید بعد با استفاده از محلول رنگ بر الکل – استن که بر روی گستره می ریزید بسرعت آنرا بی رنگ کنید. دقت کنید مرحله بی رنگ سازی بیش از اندازه نباشد. بعد از آن لام را بسرعت بشوئید . این عمل ، بی رنگ شده را متوقف خواهد کرد.

۶-        رنگ آمیزی با سافرانین : در این مرحله سطح گسترش را با رنگ ثانویه یعنی سافرانین بپوشانید و ۳۰ تا ۶۰ ثانیه صبر کنید . بعد از آن رنگ اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.

۷-        لام رنگ آمیزی شده را آهسته روی کاغذ خشک کن قرار دهید ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.

نکات مهم :

۱-        حرارت بیش از اندازه هنگام تثبیت گسترش باعث پاره شدن دیواره سلولی باکتری شده . بنابراین باکتری گرم مثبت رنگ اولیه (کریستال ویوله) را هنگام رنگ بری از دست می دهد و رنگ ثانویه را جذب می نماید و در نتیجه باکتری گرم مثبت ، بصورت گرم منفی دیده می شود.

۲-        اگر گسترش ضخیم باشد هنگام مرحله بی رنگ شدن ، ممکن است مانند یم گسترش معمولی رنگ نشود و این مسئله باعث خطا در تشخیص شما در گرم منفی یا مثبت بودن باکتری خواهد شد.

۳-        غلظت درست و تازه بودن رنگها هم در رنگ آمیزی موثر است .

۴-        رنگ بری بیش از حد ممکن است باعت پاره شدن جدار باکتریهای گرم مثبت شده در نتیجه این باکتریها رنگ کریستال ویوله خود را از دست داده و رنگ ثانویه را جذب می نماید و بصورت گرم منفی دیده می شود.

۵-        دقت شود هنگام تهیه گسترش روی لام از محیط کشت ، سن کشت باکتری باید ۲۴ ساعت یا کمتر باشد . بنابراین در محیط کشتهایی که از عمر آنها گذشته و کهنه شده اند ، در قابلیت نفوذ دیواره سلولی باکتریها تغییراتی حاصل می شود که خاصیت گرم مثبت بودن را از دست می دهد.

در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به ۵ گروه تقسیم بندی می کنند:

۱-        میله ای (باسیل ) گرم مثبت ۲- میله ای گرم منفی ۳- کوکوس (گرد) گرم مثبت ۴- کوکوس گرم منفی ۵- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.

در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این ۵ گروه قرار داده و با اطمینان ۴ گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .

خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :

۱-        باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.

۲-        گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.

۳-        باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .

۴-        باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و هضم و متلاشی شده آن می شوند.

طرز تهیه رنگها و محلولهای گرم :

۱-        کریستال ویوله :

- کریستال ویوله                        ۲ گرم

- اتانول ۹۵%                         ۲۰سی سی

- اگزالات آمونیوم(خالص)           ۸/.گرم

- آب مقطر                             ۸۰سی سی

کریستال ویوله را در اتانول حل کنید. اگزالات آمونیوم را در آب حل کنیدو سپس دو محلول را روی هم ریخته و بخوبی مخلوط کنید.

۲-        محلول ید:

- ید                                       ۱ گرم

- یدور پتاسیم                           ۲ گرم

- آب مقطر                             ۳۰۰ سی سی

ید و یدور پتاسیم را با هم در هاون بسائید تا کاملا نرم شود . مقدار کمی آب اضافه کنید تا محتویات هاون شسته شود. بقیه آب را هم اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید . این محلول را باید در شیشه تیره رنگ نگداری کنید.

۳-        محلول سافرانین :

- سافرانین                              ۲۵ گرم

- اتانول ۹۵%                         ۱۰سی سی

- آب مقطر                             ۱۰۰سی سی

سافرانین را در اتانول حل کنید . آب مقطر را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را از کاغذ صافی عبور دهید.

۴-        محلول استن – الکل :

- اتانول ۹۵%                        ۷۰ سی سی

- استن                                  ۳۰سی سی

دو محلول را کاملا با هم مخلوط کنید.

آزمون حلالیت در پتاس:

ابتدا یک قطره از محلول پتاس ۳% روی یک لام تمیز ریختیم.سپس توسط یک چوب کبریت مقداری از کشت تازه ی باکتری را برداشته و در محلول پتاس (KOH) به طور دورانی حرکت دادیم.و چوب کبریت را پس از ۱۵-۱۰ ثانیه از روی لام بالا کشیدیم.باکتری های گرم منفی در اثر تخریب دیواره و بیرون ریختن DNA و سایر مواد داخل سلول یک حالت چسبندگی و کشسانی نشان می دهند ، در صورتی که در مورد باکتری های گرم مثبت اینچنین نیست.باید در مورد زمان به هم زدن باکتری ها در KOH دقت کنیم زیرا باکتری های گرم مثبت هم اگر زیاد در پتاس بمانند دیواره ی سلولیشان تخریب شده و همان حالت کشسانی را از خود نشان می دهند.